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蛋白质纯化方法经典攻略(三)
  • 发布日期:2022-03-18     信息来源:      浏览次数:360
    • 那么下面上海嘉鹏科技有限公司为大家简单介绍一下关于蛋白质纯化方法经典攻略(三):

      离子交换层析

      离子交换层析分离蛋白的原理是基于其净电荷的不同,通过蛋白质与带电荷的固定相之间的静电作用力进行分离。

      IEX有以下两类: (1)阴离子交换层析 (固定相带正电荷,与带负电的蛋白质相结合);(2)阳离子交换层析(固定相带负电,与带正电的蛋白质相结合)。离子交换层析常用于蛋白质纯化工艺中期。但是,对某些蛋白,在纯化工艺的前期或后期采用该方法亦可获得良好的分离效果。

                                                                       图 5. 蛋白质净电荷受其溶剂pH值影响。

      当pH=pI时,蛋白质净电荷为0,因此既不与阴离子交换的固定相也不与阳离子交换的固定相相结合。调节pH值高于或低于pI值可使蛋白质带上净电荷,使其与阴离子交换树脂(pH > pI)的固定相或者阳离子交换(pH < pI)的固定相相结合。
      由于氨基酸的基本结构和与其共价结合的修饰成分的影响,所有的蛋白质都会带有净电荷。由于溶剂可以与蛋白质相互交换氢离子,因此蛋白质的净电荷受其溶剂pH值的影响。蛋白质的等电点(pI)是蛋白质不带电时的pH值。当pH值高于pI时,蛋白质会带负电,而当pH值低于pI时,蛋白质带正电。因此,可以通过调节溶液的pH值来控制结合蛋白是与离子交换柱结合或是从柱上洗脱。
      理论上来说,只要缓冲液pH值调节合适,所有的蛋白质都可以与阳离子交换柱和阴离子交换柱结合。但是,蛋白质纯化过程中,选择纯化条件和层析柱类型时*重要的考虑因素就是要保持蛋白质的稳定性。因此,选择哪一种离子交换层析和选择什么样的条件会影响蛋白质稳定性和活性是必须要考量的。通常,一些与某类离子交换层析相结合的条件可能对某种蛋白质比对其他蛋白质更为合适。
      了解蛋白质等电点的知识可帮助寻找*合适的离子交换层析方法。以下在线工具可计算一个蛋白质的理论等电点 EXPASY。这些计算都完全基于蛋白质的氨基酸序列,不考虑其三维空间结构。而在实际情况中,一个蛋白质的某些残基可能暴露得比其他部分更多,所以,其实际pI和表面净电荷某些时候可能与理论计算值不尽相符  。氨基酸的相对位置分布同样会影响一个蛋白质的pI值 ,而这一点在理论计算时同样未予考虑。有些技术可通过实验方法测得蛋白质实际的pI值,如等电聚焦电泳 、等电聚焦毛细管电泳 和高通量光学测量法等 。
      蛋白质与IEX的结合必须采用较宽pH值范围的溶液进行多次尝试以获得*合适的蛋白质保留pH值。在pI值左右1个pH单位的溶液pH值通常认为是较合适的蛋白质结合pH值。但是,在有些情况下,也可能需要在远离pI值的pH值条件下进行 。

      图 6. 离子交换层析。


      蛋白质在低离子强度条件下与带电的固定相相结合。结合的蛋白质可以通过增加缓冲液的离子强度或者调节其pH值进行洗脱。
      IEX的固定相是由惰性琼脂糖或者高分子基质与带电基团共价结合组成。介质微粒有很多尺寸,可以无孔,也可以有多种不同尺寸的孔。介质的选择主要根据所需的结合能力、分辨率和流速要求来决定。介质颗粒尺寸越小,分辨率越高,但相应的流速也越低,分离时间也更长。多孔介质比无孔介质的结合能力更强。无孔介质中,蛋白质不能进入树脂内部,因此相比多孔介质,前者的样品回收率更高,分辨率更高,分离时间也更短。一个研究表明,对于大多数蛋白质,采用无孔介质和多孔介质的分辨率和回收率都类似,但对于尺寸较大的蛋白质,多孔介质由于体积排阻效应而在分辨率上有一定损失。
      IEX中*常用的4种带电官能团如下所示。它们根据离子交换能力的强弱分类,强离子交换基团可离子化的pH范围比弱离子交换基团的范围更大。
      阴离子交换 (固定相带正电):1、季铵(Q) - 强阴离子交换基团2、二乙氨乙基(DEAE) -弱阴离子交换基团
      阳离子交换 (固定相带负电):1、磺酸甲酯(S) -强阳离子交换基团2、羧甲基(CM) - 弱阳离子交换基团
      因为强离子交换基团的活性基团在很大的pH范围内均可保持带电,它可以在蛋白质结合所需pH值是特别强的酸性或碱性的情况下使用(假设该pH值下蛋白质稳定性仍得以保持)。有些蛋白质在弱离子交换上的保留较弱,使得它们可以用较低的离子强度洗脱 。由于高离子强度会影响部分蛋白质的稳定性,而弱离子交换不需要在ji端的pH值条件下进行蛋白质的结合,因此可能对蛋白质更合适。
      离子交换色谱的固定相首先用低离子强度的缓冲液平衡,然后将蛋白质样品用和平衡过程相同离子强度的缓冲液上样到固定相。结合的蛋白质在用更高离子强度或pH值不同(图6)的缓冲液洗脱前先淋洗一段时间。洗脱缓冲液中的抗衡离子与带电的固定相相互作用,取代了柱上的蛋白质。在离子交换层析中,某些盐类代替结合蛋白和保持蛋白质稳定性的能力,可能比其他种类的盐可能更有效 。
      NaCl或KCl是洗脱液中*常用的盐类,其中Na+或K+是阳离子交换层析中的抗衡离子,Cl-是阴离子交换层析中的抗衡离子。另一方面,还可以通过调节缓冲液的pH值来减少蛋白质的电荷并破坏其与固定相之间的相互作用。对于结合到阳离子交换固定相上的蛋白质,增加缓冲液pH值会使蛋白质所带正电荷减少,因此可将其从柱上洗脱下来。对于结合到阴离子交换固定相上的蛋白质,降低pH值可减少蛋白质所带负电荷将其从柱上洗脱下来。
      同时,还可以调节缓冲液的pH值使目标蛋白质不与离子交换固定相相结合,而与此同时杂蛋白与固定相结合。如此,可在穿透液中收集目标蛋白质,而杂蛋白通过与固定相结合得以去除。
      与其他层析方法相比,离子交换层析在确定蛋白质结合、洗脱和获得足够高的分辨率的*佳条件时可能需要解决更多的问题。


      凝胶过滤层析

      凝胶过滤又称为分子筛及体积排阻,体积排阻层析是根据蛋白质具有不同的水力学半径将它们进行分离,该数据主要通过测量分子尺寸和形状两方面信息获得。与上述其他层析过程不同的是,蛋白质不与SEC的固定相相结合,而是依靠它们通过惰性固定相的速度不同来完成分离。

      图 9. 三种不同水力学半径的蛋白质混合物用体积排阻色谱柱分离。


      大蛋白因为不能进入介质孔道内部而只能直接流经柱体*先流出。稍小的蛋白质会进入介质孔道内部,流经的路径更复杂,因此需要更多的时间来穿过介质并流出柱体
      基于SEC可分辨不同种类蛋白的能力,它通常是一种用于*后一步纯化的有效方法。低聚物 、去折叠的蛋白分子和缺失蛋白都可以在逐渐置换缓冲液的过程中与结构完整的天然蛋白质分子分离开。通常,由于SEC可使用溶剂种类更多,所用的缓冲盐也更少,因此比透析的缓冲液置换过程更快也更可靠。整个SEC过程都只使用一种溶剂,而市购的SEC固定相几乎与所有常规的缓冲液兼容。
      固定相的类型和柱子的长度对蛋白质的SEC分离的分辨率有很大的影响。市场上有很多种固定相可选,其选择*好是根据待分离蛋白质分子的分子量和分离条件两方面来决定。
      与其他层析方法一样,SEC同样既有优点也有缺点。是否采用SEC要取决于蛋白质本身及其后续应用的要求。
      SEC的优点:1、可进行缓冲液交换和脱盐。2、可分离其他纯化技术难以分离的相似品种(如蛋白片段和低聚物)。3、可与多种溶剂相容。4、不依赖于蛋白质的任何一种特殊形式进行保留和洗脱。
      SEC的缺点:1、分离效果严重依赖柱子的填装效果。2、蛋白质与介质间有非特异性相互作用,会降低分辨率。3、对复杂的蛋白质混合物分辨率低。4、为保证足够的分辨率,上样量必须较小。这对沉淀得到的高浓度蛋白质是一个问题。
      要优化SEC条件以获得*好的分离效果,常常需要耗费大量时间,而一些因素会对分离效果产生非常大的影响。
      提高SEC分离效果的条件:1、上样体积尽量*小。上样体积越小,洗脱组分的扩散将会越弱。2、缓冲液中加盐。少量的盐有助于防止蛋白质与固定相间的非特异性相互作用。这将保证所有的蛋白质可以稳定地流过整个层析柱。3、采用合适的流速。流速过快使得小分子没有足够的时间流经介质孔道,流速过慢则会导致样品扩散时间增加。4、保证样品和溶剂的黏度接近。调整样品的条件使其与洗脱缓冲液的类似。5、调整层析柱长度。柱子过短使蛋白质分离不充分。而柱子过长则使得蛋白质样品扩散严重。6、重装柱子。柱子的填装效果会蛋白质的分离效果有相当大的影响。如果介质颗粒没有分布均匀或者填装时带入气泡,蛋白质将不能顺利地流过固定相。此外,如果柱子跑干了,就必须重装。柱子填装不好通常就是分离效果不好的原因。
      由于SEC并不是基于蛋白质官能团间的相互作用来进行分离,所有的蛋白质都在相同的条件下进行洗脱,所以分离效果仅仅依赖于蛋白质各自不同的水力学半径。因此,SEC通常不适合在含有较多杂蛋白的纯化工艺前期使用。但是,SEC又可作为一种快速可靠的样品脱盐或者小分子去除方法用于分离工艺前或中期。在纯化的*后阶段,当只剩痕量杂蛋白时,SEC则是一种蛋白质分离和置换保存缓冲液的有效方法。
      以上就是上海金鹏分析仪器有限公司为大家整理总结蛋白质纯化方法经典攻略(三)。
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