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蛋白纯化系统中亲和纯化常见问题我们如何解决?
  • 发布日期:2021-08-23     信息来源:      浏览次数:471
    • 那么下面上海嘉鹏科技有限公司为大家简单介绍一下关于蛋白纯化系统中亲和纯化常见问题我们如何解决?

      感谢使用上海金鹏蛋白纯化系统Blupadstart进行蛋白纯化分离实验。
      1. 镍柱使用中出现棕色是怎么回事?
      出现这样的情况,主要是缓冲液中 DTT 的影响, DTT 会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响,在碱性的缓冲液条件下镍离子会被 DTT 还原生成
      棕色的沉淀,所以所有镍柱的生产商都强调要尽量避免 DTT 的参与(一般的镍柱耐受小于 5mM DTT,推荐缓冲液中不要超过2mM DTT)。
      2. 通过 His 标签纯化的蛋白,杂带比较多,如何改进?
      (1)如果蛋白纯化的是上清,蛋白酶会部分降解目的蛋白,可通过加多种蛋白酶控制剂改进。
      (2)可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度,以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。
      (3)杂蛋白和目的蛋白结合,可通过超声前加入去垢剂的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。
      3. 镍柱堵了怎么办?
      (1)柱子发生堵塞,可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致,所以样品一定要高速离心。
      (2)上清纯化时,蛋白发生变性,有絮状物产生,赶紧加入 1-2mM DTT (上清样品处理要在冰浴中进行),还不行加尿素变性,使其在变形环境下。
      (3)样品处理时的料液比不要太小,否则黏度大,或者导致蛋白析出或变性,料液比要在1/10-1/15 之间较适宜。
      4. 纯化过程中,蛋白出现了浑浊,怎么办?
      (1)出现浑浊,说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定,所以要检查缓冲体系是否正确,环境是否低温,或在缓冲液中加入还原剂 DTT。
      (2)加入肌氨酸钠,迅速使蛋白变性,消除浑浊现象。
      5. 如何处理样品,可使其初步提纯(如何洗去蛋白的自身带)?
      (1)上清样品处理,要加入去污剂,蛋白酶控制剂,还原剂,还要注意温度及超声破碎的参数。
      (2)去大肠杆菌自身带(两条 30KD-40KD)可用非变性缓冲液超声悬浮(加入去垢剂),离心 6000r/min,30min,10℃。(若效果不够可继续上述步骤)。
      (3)大肠杆菌包涵体的洗涤,可用包涵体洗液多洗几遍,也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解,可选取其中纯度较佳的。
      (4)可用硫酸铵沉淀法,初步提纯。
      6. 蛋白挂在柱子上洗脱不下来,怎么解决?
      (1)洗脱条件太温和(组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上,结合力较强) 策略:用增加咪唑的梯度洗脱或降低 pH 来找出较佳的洗脱条件。
      (2)降低 PH 的方法洗脱的,因 为若 PH 低于 3.5,会导致镍离子脱落 策略:改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱
      (3)蛋白已沉淀在柱上 策略:减少上样量和孵育的时间,试用去污剂(1%-2%Tritonx-100)或改变 NaCl 的浓度,或在变性条件下洗脱(用 8M 脲,或 6M 盐酸胍),也可在洗脱 Buffer中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸钠进行洗脱。
      (4)非特异性疏水或其他相互反应 策略:加非离子去污剂到洗脱缓冲液(如,2%Triton X-100)或增加 NaCl 的浓度。
      7. 没能纯化到带 His 标签的蛋白,蛋白都流穿了(未挂柱)?
      (1)超声的功率不对(太大,蛋白炭化,太小,蛋白没有释放) ;
       策略:改变超声功率,并在超声前加入溶菌酶。
      (2)样品或者是结合缓冲液不正确 ;
      策略:检测 pH 及样品和结合缓冲液的组成份(EDTA)。
      (3)组氨酸的标签没有完全的暴露 ;
       策略:在变性条件下(用 8M 脲,6M 盐酸胍,1%SDS) 并加入 1-2mMDTT 进行纯化。
      (4)His 标签丢失;
      策略 1:WB 或者 anti-his 的抗体检查 His 是否表达,上游构建,改变his-tag 的位(C-terminal or N-terminal),必要时增加 his 个数(常用 6-10 个);
      策略 2:孵育的时间不够,降低流速和增加孵育的时间;
      策略 3:改变螯合的金属离子,寻找到较佳的结合金属离子。
      Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数(组氨酸)6 标记的重组蛋白质的金属离子,也是一般常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响,包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的 pH,因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用 Ni2+。可以利用 Hitrap IMACHP 来筛选不同的金属离子。

      以上就是上海嘉鹏科技有限公司为大家整理总结关于蛋白纯化系统中亲和纯化常见问题我们如何解决?

       

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