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琼脂糖凝胶电泳的原理及实验过程
  • 发布日期:2019-02-25     信息来源:      浏览次数:2308
    • 实验原理
          琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定 DNA、RNA 分子混合物,以琼脂凝胶作为支持物,利用 DNA 分子在电场中时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中由阴极向阳极运动。在一定的电场强度下,忽略DNA分子携带的电荷,DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与相对分子量成反比。
          不同构型的 DNA 分子的迁移速度不同。如环形 DNA 分子样品,其中有三种构型的分子:超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDNA)、和线形 DNA 分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA>IDNA>ocDNA。
          核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质。琼脂糖是一种聚合链线性分子;聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(Acr)在 N,N,N′-四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵(AP)的催化下聚合形成长链,并通过交联剂 N,N′-亚甲双丙烯酰胺(Bis)交叉连接而成。琼脂糖凝胶适合分离200bp至近50kb的DNA片段,而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段(5bp-500bp)的分离效果很好,且分辩力极高。选择不同浓度的凝胶,可以分离丌同大小范围的 DNA 分子。电场强度愈大,带电颗粒的运动赹快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小,所以电泳时一般采用低电压,不超过 6V/cm。而对于大片段电泳,可以选择 0.5-1.0V/cm 电泳过夜。如果选择高电压电泳,可使用聚丙烯酰胺凝胶。
          核酸电泳常采用 TAE、TBE、TPE 三种缓冲系统。TAE 价格低廉,但缓冲能力低。TPE 在进行 DNA 回收时,会使 DNA 污染磷酸盐,影响后续反应。所以综合考虑,多采用 TBE 缓冲液。
          核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭(EB)。溴化乙锭是一种扁平分子,可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射 BE-DNA 复合物时,通过发光指示核酸的位置。由于EB有较强的挥发性和毒性,现在大多选择EB替代品进行试验,比较常用的有gelred,goldview,ybr-green等,但是整体效果都若于传统的EB。
      材料、试剂及器具
      1、材料
      合适的Marker(分子量标准);DNA 样品
      2、试剂
      加样缓冲液(6x或10x);琼脂糖;溴化乙锭(EB)。
      3、器具
      (1)电泳系统:电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。
      (2)凝胶成像系统或紫外透射仪。
      实验过程
      1、按所分离的 DNA 分子的大小范围,选择合适的比例的凝胶,称取适量的琼脂粉,放到一锥形瓶中,加入适量的 TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至琼脂粉完全溶化,溶液透明。稍摇匀,得胶液。待胶液却至 60℃左右,在胶液内加入适量的比例的溴化乙锭液。
      2、水平放置胶槽,在一端插好梳子,在槽内缓慢倒入已况至 60℃左右的胶液,使之形成均匀水平的胶面。
      3、待胶凝固后,小心拔起梳子,使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。
      4、在槽内加入TBE电泳缓冲液,至液面覆盖过胶面。
      5、把待检样品,按合适比例与加样缓冲液混匀,用移液枪加至凝胶的加样孔中。
      6、接通电泳仪和电泳槽,并接通电源,调节合适电压,稳压输出,开始电泳。
      7、观察溴酚兰的带(蓝色)的位置。当其移动至约凝胶长2/3处时,可停止电泳。
      8、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜,赶去气泡平铺,然后把凝胶放在上面。关上样品室外门,打开紫外灯(360nm 或 254nm),通过观察孔进行观察。
      注意事项
      1、电泳中使用的溴化乙锭(EB)为中度毒性、强致癌性物质,务必小心,勿沾染于衣物、
      皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门电泳区域操作,戴一次性手套,并及时更换。
      2、预先加入EB 时可能使 DNA 的运动速度下降15%左右,且不同构型的 DNA 的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色。EB在光照下易降解,若凝胶放置一段时间后才观察,即使原来胶内或样品已加 EB,建议选择EB溶液浸泡染色。
      3、加样进胶时不要形成气泡,需在凝胶液未凝固之前及时**,否则,需重新制胶。
      4、电泳时溴酚兰在琼脂糖凝胶中的运动速度可以用于参考电泳速度,已实际电泳条带运动速度为准。
      常见问题分析
       

      常见问题

      原因

      对策

      DNA条带模糊

      DNA降解

      实验过程避免核酸酶污染

      电泳缓冲液陈旧

      电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,PH值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。TBE建议使用10次就更换缓冲液

      所用电泳条件不合适

      电泳时电压不应超过6V/CM,温度<30℃,巨大DNA链电泳,温度应<15℃,核查所用电泳缓冲液的缓冲能力,注意经常更换

      DNA上样量过多

      减少凝胶中DNA上样量

      DNA含盐过高

      电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分

      有蛋白污染

      电泳前酚抽提去除蛋白

      DNA变性

      电泳前勿加热,用TE缓冲液稀释DNA

      出现片状拖带或涂抹带

      PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往PCR体系需要优化,PCR程序需要摸索。

      其对策有:调整PCR体系和PCR程序,摸索出合适的条件。

      不规则DNA带迁移

      电泳条件不合适

      电泳时电压不应超过6V/CM,温度<30℃,巨大DNA链电泳,温度应<15℃,核查所用电泳缓冲液的缓冲能力,注意经常更换

      DNA变性

      电泳前勿加热,用TE缓冲液稀释DNA

      带弱或无DNA带

      DNA上样量不够

      增加DNA上样量,聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高,上样量可适当降低

      DNA降解

      实验过程避免核酸酶污染

      DNA跑出凝胶

      缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度

      EB染色的DNA,所用光源不合适

      应用短波长(254nm)的紫外光源

      DNA带缺失

      DNA跑出凝胶

      缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度

      分子大小相近的DNA带不易分辨

      增加电泳时间,核准正确凝胶浓度

      DNA变性

      电泳前勿加热,用20mM Nacl 缓冲液稀释DNA

      DNA链巨大,常规凝胶电泳不合适

      在脉冲凝胶电泳上分析

      电泳时Ladder扭曲

      配胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配置

      同时配置,电泳缓冲液高出液面1-2mm即可

      电泳时电压过高

      电泳时电压不应超过6V/CM

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