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蛋白质技术专题:血清蛋白琼脂糖凝胶电泳
  • 发布日期:2019-02-27     信息来源:      浏览次数:702
    • 【原理】
      琼脂糖(agarose)是经过挑选,以质地较纯的琼脂(agar)作为原料而制成的。琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一含有硫酸根和羟基的多糖,它具有离子交换性质,这种性质会给电泳及凝胶过滤以的影响。琼脂糖是直链多糖,它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成。
      琼脂糖主要通过氢键而形成凝胶。电泳时因凝胶含水量大(98-99%),近似自由电泳,因为固体支持物的影响少,故电泳速度快,区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团,电渗影响很少,是一种较好的电泳材料,分离效果较好。
      血清中脂类物质与血清载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白(lipoprotein)形式存在。各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同,各种脂蛋白颗粒大小也相差很大,因此,以琼脂糖凝胶为支持物,在电场中可使各种脂蛋白颗粒分离开来。
      琼脂糖凝胶电泳分离血清蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑(或油红等)进行预染。再将预染过的血清加样于琼脂糖凝胶板加样槽中,通电后可以看到脂蛋白向正极移动,并分离出几个区带。
      正常人血清脂蛋白可出现三条区带,从阴极到阳极依次为β-脂蛋白(深),前β-脂蛋白(浅)及α-脂蛋白(比前β-脂蛋白略深些),在原点处应无乳糜微粒。有时前β-脂蛋白也显示不出来。
      琼脂糖主要通过氢键而形成凝胶。电泳时因凝胶含水量大(98-99%),近似自由电泳,因为固体支持物的影响少,故电泳速度快,区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团,电渗影响很少,是一种较好的电泳材料,分离效果较好。
      血清中脂类物质与血清载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白(lipoprotein)形式存在。各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同,各种脂蛋白颗粒大小也相差很大,因此,以琼脂糖凝胶为支持物,在电场中可使各种脂蛋白颗粒分离开来。
      琼脂糖凝胶电泳分离血清蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑(或油红等)进行预染。再将预染过的血清加样于琼脂糖凝胶板加样槽中,通电后可以看到脂蛋白向正极移动,并分离出几个区带。
      正常人血清脂蛋白可出现三条区带,从阴极到阳极依次为β-脂蛋白(深),前β-脂蛋白(浅)及α-脂蛋白(比前β-脂蛋白略深些),在原点处应无乳糜微粒。有时前β-脂蛋白也显示不出来。

      【操作】
      1、预染血清血清0.2ml中加苏丹黑染色液0.2ml,混合置37℃水浴中染色30分钟,离心(2000转/分)约5分钟。以除去悬浮于血清中染料沉渣。
      2、制备琼脂糖凝胶板将已配制好的0.5%琼脂糖凝胶于沸水浴中加热融化,用吸管吸取凝胶溶液浇注在载玻片上,约3 ml。静置半小时后凝固(天热时需延长,也可放入冰箱中数分钟以加速凝固)。
      3、点样将剪好的滤纸条对折,以折边在距凝胶一端2cm处切一点样口。将毛细管插入预染好的血清中,待吸入部分血清后,取毛细管使其有样品的一端靠于点样口端部,停靠3秒左右。
      4、电泳将凝胶板平放入电泳槽中,使加样端接在阴极一侧,用四层滤纸或纱布做成“引桥”,敷于胶板的两端,各搭住凝胶板约1cm左右,“引桥”的另一端浸于电泳槽内的缓冲液中。接通电源,首先调节电流为3-4mA/凝胶板,电泳10-15分钟;然后调节电流为6-7mA/凝胶板,电泳30-40分钟,即可观察到分离的区带。
      5、如果需要保留电泳图谱,可将电泳后的凝胶板(连同载玻片)放入清水中浸泡脱盐2小时,然后放烘箱(80℃左右)中烘干即可。

      【试剂】
      1、苏丹黑染色液将苏丹黑B加到无水乙醇中至饱和,摇荡使乙酰化。用前过滤。
      2、缓冲液称取钠15.4g、2.76g及EDTA0.29g,加水溶解后再加蒸馏水至1000ml(pH为8.6,离子强度0.075),为电极缓冲液。
      3、凝胶缓冲液取三羟甲基氨基甲烷1.212g、EDTA0.29g及NaCl5.85g,用蒸馏水溶解后,稀释至1000ml,pH为8.6。
      4、琼脂糖凝胶称取琼脂糖0.45 g溶于50 ml凝胶缓冲液中,再加水50 ml。在水浴中加热至沸,待琼脂糖完全溶解后,立即停止加热。

      【注意事项】
      1、电泳样品应为新鲜的空腹血清。
      2、加热溶化琼脂时,须防止水份蒸发过多。琼脂糖凝胶随用随制,以免凝胶表面干燥,影响分离效果。
      3、制作凝胶板时琼脂糖浓度一般选用0.5%左右为宜,高于1%以上α-脂蛋白部分较紧密,β和前β-脂蛋白部分不够清晰;低于4.5%则凝固性较差,图谱不清。
      4、点样口要大小适宜,边缘整齐、光滑,否则会影响电泳图谱。
      5、在α-脂蛋白前若出现较浅区带,可列为前α-脂蛋白。

      【正常参考范围】
      α-脂蛋白 20~30%
      β-脂蛋白 20~30%
      前β-脂蛋白 0~28%
      乳糜微粒(-)

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